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示蹤細胞

前言

 動物模型實驗是藥物研發(fā)和生物醫(yī)學(xué)研究不可或缺的手段，在新藥試驗、疾病診斷、藥物與醫(yī)療器械安全性研究等領(lǐng)域被廣泛使用，通過動物實驗，可取得真實可靠的研究數(shù)據(jù)。

活體成像原理

      活體成像技術(shù)方法主要分為生物發(fā)光和熒光兩種：生物發(fā)光技術(shù)主要是用熒光素酶(Luciferase)標記細胞，而熒光技術(shù)是用熒光蛋白(如GFP,RFP等)對細胞進行標記。兩種方法各有優(yōu)缺點：
 生物發(fā)光活體成像是指在小的哺乳動物體內(nèi)利用熒光素酶基因表達所產(chǎn)生的熒光素酶蛋白與其小分子底物熒光素在氧、Mg2+離子存在的條件下消耗ATP發(fā)生氧化反應(yīng)，將部分化學(xué)能轉(zhuǎn)變?yōu)榭梢姽饽茚尫?，在體外利用敏感的CCD設(shè)備形成圖像。該方法靈敏度高，特異性強，無自發(fā)光，背景低，不需要光照激發(fā)，它也有不足之處：波長依賴性的組織穿透能力，血紅蛋白是吸收光子的主要物質(zhì);每次成像前需要給動物麻醉和注射熒光素酶(Luciferase)底物，會增加人力和試劑成本，底物在體內(nèi)的分布與藥代動力學(xué)會影響發(fā)光信號。常用的熒光素酶底物：

 Name
 D-Luciferin Firefly,free acid  D-熒光素，游離酸
 D-Luciferin Sodium salt  D-熒光素鈉鹽
 D-Luciferin Potassium salt  D-熒光素鉀鹽
 L-Luciferin,potassium salt  L-熒光素鉀鹽
 Fluorescamine  熒光胺
 Coelenterazine  腔腸素

 

熒光活體成像技術(shù)是通過激發(fā)光將細胞標記的熒光基團激發(fā)到達高能量狀態(tài)，而后產(chǎn)生發(fā)射光?？紤]到不同熒光物質(zhì)的發(fā)射光譜和激發(fā)光譜不同，需要成像設(shè)備具備相應(yīng)激發(fā)光源和發(fā)射濾片。該方法對設(shè)備和試劑要求較低，熒光蛋白可選擇標記多種顏色，熒光蛋白穩(wěn)定性強，缺點是靈敏度較低，需要外源光照激發(fā)，非特異性熒光產(chǎn)生的背景噪音使其信噪比和靈敏度遠低于生物發(fā)光，激發(fā)光對動物有一定影響。

總的來說，現(xiàn)有的活體成像技術(shù)方法各有優(yōu)勢，在腫瘤相關(guān)的應(yīng)用領(lǐng)域，生物發(fā)光（Luciferase）活體成像技術(shù)的使用更為廣泛，具有重要的應(yīng)用價值。

示蹤細胞的構(gòu)建與使用

        活體成像技術(shù)的應(yīng)用過程中，示蹤細胞選擇和標記非常關(guān)鍵，示蹤細胞構(gòu)建過程如下：

1. 選擇符合實驗需求和成瘤性指標的母細胞，需要采用來源正確，成瘤性良好，傳代次數(shù)較低，狀態(tài)保持良好的細胞株作為母細胞；

2. 選擇適合的標記蛋白，常用的標記蛋白有Firefly Luciferase，GFP，EGFP, RFP, YFP等；

3. 選擇標記蛋白表達載體和基因?qū)敕绞剑ǔＳ寐《痉绞剑?，篩選穩(wěn)定細胞株；

4. 示蹤細胞體外發(fā)光測試，測定發(fā)光信號強度和細胞傳代信號穩(wěn)定性，確保示蹤細胞在體外和體內(nèi)都能穩(wěn)定高水平表達標記蛋白，以科佰生物A549-Luc細胞為例：



5. 根據(jù)實驗需要通過尾靜脈注射、皮下移植、原位移植等方法在動物體內(nèi)接種已標記的示蹤細胞。

6. 活體成像：動物經(jīng)麻醉（氣麻/針麻）后放入成像暗箱平臺，開啟照明燈（明場）拍攝背景圖。關(guān)閉照明燈，在沒有外界光源的條件下（暗場）拍攝由小鼠體內(nèi)發(fā)出的特異性光子。明場與暗場的背景圖疊加后可以直觀的顯示動物體內(nèi)特異光子的部位和強度，完成成像操作。值得注意的是熒光成像需要選擇合適的激發(fā)光和發(fā)射光濾光片，生物發(fā)光則需要成像前注射luciferase底物。
7. 數(shù)據(jù)處理：動物活體成像圖像處理軟件除了提供含有光子強度標尺的成像圖片外，還能計算分析發(fā)光面積、總光子數(shù)、光子強度的相關(guān)參數(shù)供實驗者參考。

應(yīng)用介紹

 1.長期動態(tài)檢測腫瘤的生長，并可建立相應(yīng)的動物模型進行抗腫瘤藥物的篩選。動物體內(nèi)藥效實驗示例：

2.腫瘤轉(zhuǎn)移：由于活體成像技術(shù)直觀、靈敏度高的特點，成為研究腫瘤轉(zhuǎn)移的重要手段。動物體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移示例：

3.基因治療研究：利用標識蛋白基因分別標記病毒或細胞, 觀察標記病毒在體內(nèi)對細胞的靶向識別和特異性殺傷。實驗示例：

4.CAR-T治療研究：利用標識蛋白分別標記CAR-T細胞或腫瘤細胞, 觀察CAR-T細胞在體內(nèi)分布和擴增，評估對腫瘤細胞的識別和特異性殺傷效果。實驗示例：

科佰示蹤細胞株特點

       1. 優(yōu)質(zhì)母細胞，具備STR驗證數(shù)據(jù)

  2. 高信噪比

  3.體外高穩(wěn)定性


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